质谱联用(LC-MS /MS)对人乳进行肽段谱分析

人乳是一种动态的蛋白酶-蛋白酶系统,为婴儿提供活性肽,乳汁的pH值从母亲的乳腺到婴儿的消化道发生变化。 虽然在体内或体外消化过程中研究了人乳肽的释放,但这些模型并没有明显变化,也没有观察到pH的影响。本研究的目的是确定pH对人乳蛋白水解的影响,通过利用高分辨率精确质谱联用(LC-MS/MS)技术,绘制了内源性人乳肽在不同pH水平孵育前后的图谱。超过5000个多肽被鉴定出来。

通过比较分析,我们发现了74种始终独立于pH值变化的肽段,以及8种仅在pH值4或5时释放的肽段(典型的婴儿胃pH值)。 结果证明,牛奶的蛋白质水解蛋白质,尤其是β-casein聚合物免疫球蛋白受体,和α-l乳白蛋白随着PH的变化发生变化。

1.人乳样品的成分分析和蛋白水解菌分析

本文研究了母乳的成分,并记录了典型的宏量营养素浓度; 因此,我们进行了分析,以验证这些实验中使用的样本在正常范围内。

2. pH值对人乳肽含量和形态的影响

将孵育2小时后的样品肽浓度进行归一化,对照前0小时进行归一化(图1A)。 采用肽段分析方法,对牛奶样品中的内源肽进行了综合鉴定。利用高分辨率、高精度、高质量的质谱(LC-MS/MS)检测,我们在19个样本中共鉴定出5847个多肽。这些常见肽段的数量从158个到230个不等,约占各组鉴定肽段总数的5-11%。肽段长度被限制在6-50个氨基酸残基的范围内,以便进行可靠的序列分配。目前的实验设计和质谱采集设置主要是对多肽定性表征,具有较高的置信度和灵敏度,便于发现目标多肽进行进一步的定量

图1

3. 鉴定肽的来源蛋白

本研究鉴定的5847个多肽来自516个蛋白质。这些蛋白的分子功能及其基于黑豹分类系统的编码基因如图2所示。

图2

为了阐明pH值对单个人乳蛋白蛋白水解的影响,每个样品分别统计每个蛋白的独特肽段。取各处理组3个成熟乳的生物学复制物的肽数取平均值,将肽数最高的前10个蛋白绘制在气泡图中(图3)。

图3

总结

哺乳对于哺乳动物进化的成功至关重要,牛奶蛋白在调节婴儿生长发育中的作用不仅仅是提供营养。从牛奶蛋白中释放的肽被认为是蛋白质消化过程中的中间产物,进一步分解成为氨基酸的来源; 它们也可以是对生理调节至关重要的蛋白水解过程的产物。 本研究旨在明确研究pH值的影响人乳系统蛋白水解的变化。该研究模型的一个局限性是,简化的培养条件不能代表体内消化过程中的所有生理条件。母乳在婴儿消化过程中的蛋白水解受多种因素的影响,如pH值的动态变化、消化酶的数量和活性、消化道生物地理的多样性、婴儿的发育阶段和健康状况等。目前,这一过程还没有被很好地理解,对调节人乳蛋白水解过程很重要的变量可能还没有确定。为了提高我们对调控过程的理解,需要对关键控制因素进行表征。

参考文献:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6432908/

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