【方法篇】大肠杆菌组蛋白磷酸化位点鉴定新方法

数十年来,组蛋白磷酸化位点的发掘的种种困难限制了组蛋白磷酸化信号通路转导研究。此文所介绍方法可使我们对组蛋白磷酸化的生物学功能有更详尽的了解。 蛋白的磷酸化是真核生物调控每个细胞学过程的重要调控作用,磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上

尽管磷酸化修饰也会发生在组氨酸残基上,但是一直被认为是一种较为普通的蛋白磷酸化修饰类型。 自从组蛋白磷酸化被首次发现以来,研究其修饰的方法以及其生物学机制受到各种限制,尽管目前有各种研究磷酸化的新方法,但对于组蛋白来说也并不合适的。

有几个关键问题限制了对组蛋白磷酸化修饰进行大规模分析,首先是因组蛋白磷酸化的化学键没有O-磷酸化的化学键稳定,并且在酸性环境下组氨酸的磷酸化集团也会发生水解,因此常用IMAC富集方法并不适合;此处并没有用运用常规的磷酸化富集方法处理,而是采用了Fe3+IMCA柱子进行磷酸化肽段,如图1a所示。

图1

在对非酸性环境下对组蛋白磷酸化富集的过程中,有下面几项注意事项: 1. 细胞裂解使用较强的裂解液buffer 2.排除蛋白沉降过程中的分子间干扰 3.核苷酸酶的损耗 4.室温的控制 5.低温下样本拖延 6.IMAC富集的时间控制,不应超过14min

通过使用Masquant软件对数据进行分析比对,有135个磷酸化位点是较为可信的。 一般来说在质谱峰图中可以在低质量区域看到亚胺离子的很强的信号,会看到m/z为190.037的离子峰的磷酸化组蛋白肽段,如图2b.

图2

方法优点 与抗体手段相比较,此方法的差异如下: 1.能直接鉴定出组蛋白磷酸化修饰位点 2.可以全面的定性定量所有的磷酸化修饰信息 3.对样本量要求较低 4.成本上相对低廉。

文献出处:Widespread bacterial protein histidine phosphorylation revealed by mass spectrometry-based proteomics

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