用体外手段分析蛋白SUMO化修饰位点

SUMO化蛋白翻译后修饰,又称为SUMOylation,在细胞功能中起着不可或缺的作用,与DNA修复、细胞内转运、细胞信号转导和应激反应密切相关。哺乳动物细胞中比较常见的三种SUMO化修饰类型:SUMO1、SUMO2和SUMO3,其中SUMO2和SUMO3有96%的同源性,而SUMO1和其他两种修饰只有45%的序列同源性。

图1

蛋白SUMO化酶级联效应与泛素化途径具有较高的相似性,两者分子机制都需要E1(活化)和E2(结合)两种分子,如图1所示。在ATP驱动机制下,SUMO化C端羧基部分首先由SAE1/SAE2异二聚体(E1)激活,在E1和SUMO羧基之间形成硫酯键。SUMO分子集团随后通过硫代反应从E1络合物转移到Ubc9(E2)。在某些情况下,E3连接酶蛋白需要有效底物,通过提供Ubc9和底物蛋白之间的额外亲和力超过其他的作用力不佳的相互作用蛋白。当目标赖氨酸位于正向或者反向共有基序时,SUMO化则不需要E3连接酶,只需要E1和E2两种酶。目前,尚不清楚E1和E2(Ubc9)如何在E3没有参与的情况下控制如此众多的底物发生选择性SUMO化。这与泛素化形成鲜明的比对,泛素化通路过程中有10多种E1激活酶、35种E2结合酶以及数百种E3连接酶参与。蛋白质的SUMO化调控着多种细胞底物的活性,为了了解此修饰如何影响蛋白质功能,常常需要鉴定SUMO化修饰位点。然而,质谱法(MS)对赖氨酸上发生的此修饰鉴定,仍然有很大的挑战性,因为这种修饰的动力学性质、较低的化学计量性质以及胰蛋白酶消化后肽骨架上相对较大的SUMO残基。这里报道了一种多用途的方法,以确定修饰位点和体外重组蛋白的SUMO化修饰程度。与其他实验方法的比较Western Blots 传统上用于检测细胞提取物或体外实验中蛋白质SUMO化的变化。虽然这些实验可以检测细胞提取物或特定底物上蛋白质SUMO化修饰整体变化,但是很难确定哪些赖氨酸残基上发生修饰。为了利用Western Blot鉴定SUMO化位点,必须建立目标底物的各种突变文库,其中需用Arg代替每个Lys,然后对相应的突变蛋白进行体外实验。此外,如果使用Western Blotting进行分析,必须经常与SUMO1一起使用,避免SUMO发生聚合,这样会稀释信号,导致假阴性结果。此外,蛋白质SUMO化能阻断抗原表位的识别,因此产生假阴性结果。最后,Western Blot可以监测蛋白SUMO化的整体变化,但是不能确定蛋白底物不同修饰位点上的SUMO化修饰的动力学变化。 体内分析方法最初,科学家用一种带有N端His标签的Lys缺陷的SUMO类似物识别SUMO位点,还有科学家利用稳定同位素标记(SILAC)鉴定SUMO化修饰位点,还有科学家利用QQKGG SUMO变体和Lys-C结合,然后使用商业化的抗-GlyGly抗体,以识别SUMO化位点。此处用的是Ni-NTA纯化方法分离SUMO化修饰蛋白,然后进行胰蛋白酶消化,然后利用定制化抗体富集这些SUMO肽段进行后续分析。 实验流程设计工作流程如图2所示,首先,根据不同反应组分优化配比配制体外SUMO化反应,找到最优反应条件(步骤1-6)。反应结束后,对蛋白质进行还原和烷基化处理(步骤7-11),然后用Ni-NTA纯化his标签的蛋白质底物,用胰蛋白酶(步骤12-24)在微球上消化,然后用LC-MS/MS(步骤33和34)进行分析。原始数据用MaxQuant软件处理分析。

图2

每个体外反应都应包括(+)ATP和(-)ATP,则(-)ATP反应将排除任何假阳性结果,而在(-)ATP体系中任何鉴定的SUMO化修饰位点结果都应从(+)体系中排除出去,在我们实验过程中,从来没在(-)ATP体系中发现SUMO位点,如图3所示,然而串联质谱谱图可以通过手工方法确证,比如通过找寻质谱图谱峰值m/z为243,1088和132.0768进行验证。此方法以及成功鉴定了下列清单中各个蛋白的SUMO化修饰位点:RanGAP、UBE2K、HSP27、CDC73、HSF2、CHAF1A、PCNA、CBX1、Ubc9和SUMO3。SUMO3聚合链经常被用作阳性对照,反应1小时候,SUMO3的Lys-7和Lys-11发生SUMO修饰。

图3

图4

此体外SUMO化检测手段可应用于任何标记蛋白和任何SUMO1,SUMO2或者SUMO3的突变体蛋白,无论它们是单独使用还是一起使用,都可以确定所给的待检产物的底物选择性,本实验操作方法也可以用于泛素化和SUMO化通路之间的分子对话。 预期实验效果在体内研究已经确定HSP27蛋白发送SUMO化,然而体外并未确定其修饰情况。在进行质谱分析之前,我们通过Western Blot研究了HSP27的修饰状态,虽然并未检测出该蛋白发生SUMO化修饰条带,但是在发生SUMO反应之后,未修饰的底物明显减少。我们据此推断底物可能发生了SUMO化修饰,但是不能被抗体所识别,可能是因为其抗原决定簇被临近的SUMO分子所阻断。为了验证此发现,我们使用了HSP27作为底物进行了体外SUMO化实验。正如预期的那样,检测到+MgATP组中出现特异峰(Table2),说明HSP27蛋白在Lys-188位点上发生SUMO化修饰。

5Table 2 | MaxQuant SUMO3(NQTGG) diagnostic peaks.

图6是体外实验和体内实验所鉴定到的SUMO化位点的情况分析,通过体外程序在底物蛋白上发现的所有SUMO化修饰位点都与之前报道的HEK293细胞中构建的SUMO3蛋白的体内手段所得到的位点相同,这些蛋白包括RanGAP、UBE2K、HSP27、CD73、HSF2、PCNA、CBX1、Ubc9和SUMO3。

图6

因为SUMO3这种修饰在体内研究比较多,因此在进行体外实验时候也选择了SUMO3作为研究对象,可对两种不同的方法所发现位点进行比较。 方法学的一些限制对于大多数SUMO体外分析,实验步骤中没有添加E3连接酶这一步,在某些情况下,特定的蛋白质可能在体外实验中不能发生SUMO化修饰,它们可能需要适当的E3连接酶模拟体内实验,完成SUMO化修饰。在已知E3连接酶体系中,可以在E3连接酶的存在下进行体外实验,而无需对实验步骤进行任何的修改。但是由于SUMO化修饰的机制简单,只需要E1和E2两种酶,因此实验方法仅仅限于进行SUMO化分析,如果想将此方法应用在泛素化修饰分析,那么需要知道每个底物的E1,E2和E3的不同组合情况,这也会使整个工作变得更加琐碎。 此篇主要讲述了SUMO化修饰位点分析的一种思路,大部分主流实验室还苦于通过用传统WB方法分析SUMO化修饰,如今质谱的快速发展给分析蛋白SUMO化修饰提供了种种可能,希望此篇能抛砖引玉给大家带来启发。

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