半胱氨酸氧化还原修饰及其相关检测方法

活性氧与氮可与Cys反应,形成几种可逆(S-亚硝基化、S-谷胱甘肽化、磺酸化、分子间和分子内二硫键和S-巯基化)或不可逆(亚砜或亚磺酸)修饰之一。 氧化半胱氨酸修饰的修改,列出了几种常见的生理可逆和不可逆氧化还原修饰,通常发生在半胱氨酸的硫醇侧链上。亚磺酸修饰处于可逆和不可逆的中间状态,在一些特殊的情况下,发现它是可以被酶逆转的。

下文将对用来监测Cys氧化还原修饰状态的蛋白组方法进行总结,这些技术对剖析信号事件和氧化还原调节提供的极大的可能。

图1

S-nitrosylation

S-亚硝基化也称为S-亚硝化,是硝基离子(NO+)共价结合在半胱氨酸上,相当于形成了一个硫醇的形式。

由于SNO修饰非常不稳定,因此使用传统的生化方法检测具有较大的挑战性。在游离硫醇被封闭(NEM,MMTS或者碘乙酰胺)的情况下使用一种替换策略,SNO修饰则被抗坏血酸进行还原那么新暴露的硫醇同时被标记上活性生物素标签。一旦被修饰的位点被稳定的生物素集团标记,链霉素亲和层析方法可以很容易的检测和富集这些肽段。这种方法已经扩展到可以简单单个Cys的位点鉴定,通过引入酶切消化的方法。这导致了只有生物素化的肽段可以通过质谱来检测修饰蛋白以及单个蛋白的Cys修饰位点。

S-Sulfenylation

与SNO修饰类似,磺酰化也被称为磺酸修饰,是可逆的不稳定的一种修饰,传统方法较难检测。亚磺酸是由过氧化氢氧化硫形成的R-SOH集团所生成的一种氧化物。最开始出现了许多以磺化为目标的方法。更常见的是,用二甲基酮去修饰磺胺酸。也有方法是通过双甲酮的方法进行标记结合生物素或者叠氮, 这个反应是被证明可以直接靶向SOU集团,不需要阻断步骤(生物素转换方法)或者特定的还原剂。一旦被标记,生物素集团或叠氮化物探针,可用于富集后检测。

S-Glutathionylation

除了活性氧和氮,还有其他潜在的硫醇反应,如谷胱甘肽化(GSH),可导致氧化后翻译的更改,GSH是一种含有半胱氨酸的三肽(谷氨酸-半胱氨酸-甘氨酸),作为氧化态的电子供体与半胱氨酸Cys形成稳定但可逆的混合二硫键。S-谷胱甘肽修饰可以通过上述生物素转换实验的方法进行富集和鉴定。在应用中,我们使用谷氨酰多辛(Grx)作为特异性还原剂,它是专门针对谷胱甘肽的修饰。与其他氧化PTMs修饰相比,S-谷胱甘肽化修饰是一种相对稳定的修饰,可以根据其独特的分子集团进行直接分析。通过使用生物素标记的谷胱甘肽酯,可特异性的靶向S-谷胱甘肽化修饰。

图2

Disulfide bonds

Cys也可以通过与另一个自由的Cys发生反应产生修饰形成蛋白质二硫键,这些修饰被看作是蛋白质在内质网氧化环境中折叠时发生的静态结构特征,并在蛋白质的整个生命周期中持续存在。少量二硫化物的不断增加是动态响应细胞氧化还原环境的变化。引入新的二硫键相互作用有可能显著改变蛋白质的构想或联系,从而影响其功能。

目前最成功的检测二硫键方法是2D电泳+质谱检测,但是2D电泳是鉴定二硫化物的相互作用,确定所涉及的特殊Cys位点确比较困难。二硫键的半胱氨酸残基可以通过活性硫醇亲和珠子进行捕获。

S-Sulfhydration

另外一种氧化还原反应是S-巯基化反应,它包括可扩散气体硫化氢(H2S)与游离硫醇的反应,以形成氢过硫化物(RSSH)。这种修饰也是可逆的,并被迅速认为是多种生理过程中的重要调节机制,如血管扩张、炎症、缺血/再灌注损伤等。由于-SSH集团在性质上与二硫键相似,因此很难区分这两种修饰。

实验过程是通过使用MMTS阻断游离巯基,MMTS专门阻断游离硫醇(-SH),但是不修饰过氢硫化物(-SSH)。阻断之后,应用Bio-HPDP进行标记而不用使用任何其他的还原剂与剩余的过氢硫化物进行反应。一旦发生标记,蛋白质就可以进行后续的酶切消化,并按照标准的生物素转换过程进行分析S巯基化肽段修饰。

S-Acylation

S-酰基化是另一种可逆的,调节性的硫醇修饰。这种修饰是脂肪酸酰集团与半胱氨酸共价结合形成硫酯键。S-酰化参与了调控蛋白定位与信号转导,通常暂时将蛋白锚定到细胞膜上。S-酰化蛋白有很多包括小G蛋白,病毒膜糖蛋白,脂质阀蛋白和组蛋白变体等。生物素为基础的标记技术,利用羟胺特异性裂解硫酯键,可以特异性检测活性巯基修饰位点。

图3

小结

在过去的十年中,氧化还原反应蛋白组学取得的巨大进展,目前的方法主要集中在各种开关化学上,用更稳定和通用的标签取代不稳定的氧化还原修饰。这种方法是有效的,但是它们并没有提供一个完整的氧化还原蛋白组概况,对于特定生理和病理条件下氧化还原信号在生物体中的复杂作用,需要更加重视检测内源性修饰的敏感性。

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