本页面是二硫键「位点鉴定」服务入口。如果您已有明确的目标蛋白，需要精确定位其上的二硫键修饰位点，请在此选择对应服务。如需在全蛋白水平进行系统性二硫键分析，请访问 二硫键蛋白质组学。
二硫键是蛋白内部半胱氨酸残基之间形成的共价键（-S-S-），由半胱氨酸的自由巯基氧化形成。主要由蛋白二硫键异构酶（PDI）和内质网氧化还原酶-1（ERO1）催化。二硫键是蛋白结构的重要组成部分，确保蛋白正确折叠、保持稳定构象并正常发挥功能。
二硫键在蛋白的三级结构中确保正确的折叠构象，在四级结构中对蛋白行使正常功能起决定性作用。二硫键的还原可引起某些蛋白活性的改变，这一氧化还原调控机制在细胞信号转导中具有重要意义。
二硫键分析的核心目标是：在已知的特定蛋白上，确定哪些半胱氨酸残基之间形成了二硫键，哪些保持自由巯基状态。
二硫键类型
蛋白中的二硫键可分为以下几种类型：
分子内二硫键
定义：同一蛋白分子内两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键
功能：稳定蛋白三级结构，维持正确折叠构象
典型蛋白：抗体（IgG）、胰岛素、溶菌酶、核糖核酸酶
分析特点：非还原/还原对比电泳可初步判断，质谱精确定位
分子内三级结构蛋白折叠
分子间二硫键
定义：不同蛋白分子或不同肽链之间的二硫键
功能：稳定蛋白四级结构、多亚基组装
典型蛋白：抗体轻重链、IgM 多聚体、纤维蛋白原
分析特点：非还原条件下保持连接，还原后解离
分子间四级结构多亚基
技术方案
二硫键分析采用 NEM/IAM 差异化标记策略：先用 NEM 封闭自由巯基（未形成二硫键的 Cys），再还原二硫键并用 IAM 标记新暴露的巯基。通过比较 NEM/IAM 标记模式，确定二硫键配对关系。标准流程如下：
巯基封闭NEM 烷基化封闭自由巯基
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二硫键还原DTT 还原断开的二硫键
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IAM 标记IAM 封闭新暴露的巯基
→
酶切 + LC-MS/MS酶解后高分辨质谱分析
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位点定位二硫键配对确认
服务优势
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NEM/IAM 差异化标记
通过两步烷基化精确区分形成二硫键的半胱氨酸和自由巯基的半胱氨酸，排除假阳性。
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分子内/间全覆盖
可分析分子内二硫键（稳定三级结构）和分子间二硫键（多亚基组装），覆盖所有二硫键类型。
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靶向精准
针对已知目标蛋白进行定向分析，直接给出二硫键配对关系和具体半胱氨酸位点。
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高分辨质谱平台
采用 Thermo Fisher Orbitrap Exploris 480 / Q Exactive HF-X 高分辨质谱仪（分辨率 240,000 @ m/z 200，扫描速度 40 Hz），搭配 EASY-nLC 1200 纳升液相色谱系统，确保含半胱氨酸肽段的检测灵敏度和配对确认精度。
送样要求
常规动物组织：100mg
软体动物组织：1g
常规植物组织：1g
植物果实及种子：2g-4g
细胞样本：2×107
菌类样本：150mg
最低蛋白质量：1mg
检测平台：Thermo Fisher Orbitrap Exploris 480 / Q Exactive HF-X 高分辨质谱仪（分辨率 240,000 @ m/z 200，扫描速度 40 Hz），搭配 EASY-nLC 1200 纳升液相色谱系统
位点鉴定因针对特定蛋白，样本量要求相对灵活，支持血清、重组蛋白等特殊样本，具体请咨询技术团队。
详细送样指南请参考 送样准备。
常见问题
二硫键分析和其他修饰位点鉴定有什么不同？
二硫键不是典型的翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化），而是半胱氨酸残基之间的共价连接。分析方法不使用富集策略，而是通过 NEM/IAM 差异化标记区分形成二硫键和自由的半胱氨酸，确定配对关系。
送样时需要注意什么？
避免在样本准备过程中二硫键的自然生成或破坏。样本应在低温下快速处理，避免反复冻融。温度、pH 和自由半胱氨酸残基都可能影响二硫键状态。建议使用新鲜样本或非还原条件下冻存。
送样要求是什么？
蛋白溶液或纯化蛋白 ≥ 50μg，浓度 ≥ 0.5μg/μL。也支持 SDS-PAGE 胶条（非还原条件）。对于膜蛋白或难溶蛋白，可使用变性条件（如 8M 尿素）但需避免加入还原剂。
可以分析多少个二硫键？
取决于目标蛋白的半胱氨酸数量。质谱方法理论上可定位所有形成二硫键的半胱氨酸残基。对于含多个二硫键的蛋白（如抗体含 ~16 个二硫键），可能需要多种酶切策略组合。
项目周期多长？
标准交付周期约 1-2 周。交付内容包括：原始质谱数据、二硫键配对关系表、NEM/IAM 标记模式、关键质谱谱图。
相关服务
如需在全蛋白水平进行系统性二硫键分析，或对其他修饰类型进行研究，可参考以下服务：
