iTRAQ 定量蛋白组学概述
iTRAQ（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation）是蛋白质组学定量领域的经典试剂，其构成基团由报告基团（reporter group）、质量平衡基团（balance reporter）和多肽反应基团（peptide reactive group）三部分组成。所有的标记基团都具有相同的相对分子质量 145 Da，且这些基团能够和多肽在液相过程中共同洗脱并进入串联质谱进行碎裂。[1]
不同样本的混合物被带上不同的 iTRAQ 标签，这些标签通过连接在肽段的 N 端和赖氨酸侧链氨基。随着肽段一并进入串联质谱中进行碎裂，释放报告基团（reporter group），然后根据这些报告基团的信号强度确定样本蛋白的相对丰度。iTRAQ 提供 4-plex（报告基团 114-117 Da）和 8-plex（报告基团 114-121 Da）两种规格，最多可同时比较 8 个样本。[2]
由于所有标记肽段在 MS1 水平具有相同的质荷比，iTRAQ 标记后混合上机可显著降低实验批次效应，提高定量准确性。报告基团在 MS2 水平释放后，通过各自的信号强度比值实现多通道同时定量，是中小规模样本（≤8 组）精确定量比较的首选方案。[3]
iTRAQ 定量蛋白组学的研究价值
iTRAQ 定量蛋白组学可对正常与疾病样本、正常与药物处理样本、不同时间阶段样本、生物学重复样本进行比较分析，实现高精度的蛋白相对定量，广泛应用于生物标记物发现和信号通路研究。
疾病标志物筛选
iTRAQ 多通道同时比较的设计，使得疾病组与对照组在完全相同的质谱条件下分析，有效消除技术变异。结合高覆盖度的 Orbitrap 平台，可一次性筛选数百到数千个差异蛋白，为肿瘤、代谢疾病等研究提供候选生物标志物。[4]
药物靶点与机制研究
药物处理前后的蛋白表达差异分析是药效评价和作用机制研究的核心。iTRAQ 的精确定量能力（CV < 15%）可检出低至 1.2 倍的表达变化，适合揭示药物调控的细微蛋白表达变化，为药物开发提供蛋白水平的功能证据。
多组学联合分析
iTRAQ 蛋白定量数据可与转录组、代谢组等多组学数据联合分析，构建从基因到蛋白到代谢物的完整调控网络。标记定量的高重复性为多组学整合分析提供了可靠的蛋白水平数据支撑。
Aimsmass 检测流程
Aimsmass 基于专业的 Thermo Fisher LC-MS/MS 质谱平台，提供高效、可靠的 iTRAQ 定量蛋白组学服务。标准检测流程如下：
iTRAQ 标准检测流程
样本前处理：适配细胞、组织、血清、微生物等多种样本类型，采用质谱兼容体系完成蛋白提取、还原烷基化、胰蛋白酶完整酶解，确保肽段质量和定量准确性。
iTRAQ 标记：使用 4-plex 或 8-plex iTRAQ 试剂标记肽段 N 端和赖氨酸侧链氨基。不同样本分别标记不同的报告基团标签，标记后混合为一个组分。
色谱分级与 LC-MS/MS 采集：混合后样本进行高 pH 反相色谱分级以降低复杂度，各级分再通过纳流反相色谱分离进入 Orbitrap 质谱采集 MS2 数据。
专业生信解析：基于 MaxQuant / Proteome Discoverer 进行搜库鉴定，提取各通道报告基团信号强度完成相对定量。执行严格的 FDR 质控，输出差异蛋白列表及全套可视化图表。
iTRAQ vs TMT vs DIA 对比
| 对比维度 | iTRAQ 标记定量 | TMT 标记定量 | DIA 无标记定量 |
|---|---|---|---|
| 标记方式 | 等重标记（4/8-plex） | 等重标记（6/10/16/18-plex） | 无标记 |
| 最大通道数 | 8 通道 | 18 通道（TMTpro） | 无上限 |
| 定量准确性 | CV < 15%，高精度 | CV < 15%，高精度 | CV < 15% |
| 批次效应 | 标记后混合，最低 | 标记后混合，最低 | 需严格质控 |
| 标记成本 | 中等 | 较高 | 无标记试剂，最低 |
| 适用样本量 | ≤8 组精确比较 | ≤18 组精确比较 | 大样本量队列 |
| Ratio Compression | MS2 水平存在 | MS3 可有效降低 | 不存在 |
| 推荐场景 | 中小规模精确定量 | 中等规模多组比较 | 临床大队列筛选 |
数据分析
iTRAQ 定量蛋白组学数据分析涵盖统计分析、功能注释分析和蛋白聚类与互作分析三大板块，全面展示蛋白表达差异和生物学功能信息。
统计分析
| 统计分析 |  |
全局统计分析所有鉴定到蛋白表达量的分布范围，每条曲线表示一个样本，分布是经过正态分布拟合处理后的，图中纵坐标为频数，横坐标为表达量 log10 后的数值。 |
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箱式图箱式图又称盒须图、盒式图或者箱线图，是一种表现有关数据的位置和分散情况资料的统计图。箱型图主要包含六个数据节点，可粗略表达出数据是否有对称性、分散程度等信息。 | |
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PCA 分析主成分分析（PCA 分析）是数理统计中的一种降维分析方法，将一组数据的主要矛盾提取出来，提取出的核心要素成为"成分"（component），并以百分比排序。排名靠前的主成分可以反应复杂数据中的关键信息。 | |
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火山图火山图（Volcano Plot）在一张图中显示了两个重要指标（Fold Change / p-Value），可以非常直观且合理地筛选出在样本之间发生差异表达的蛋白。 |
功能注释分析
| 功能注释 |  |
GO 注释基因的本体论（Gene Ontology）是建立一套特定的词汇集合来描述生物学功能，以此对基因功能注释统一化。用于描述生物学功能的词汇反映生物学功能的本质。 |
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KEGG 分析京都基因与基因组百科全书（KEGG）是基因组破译方面的数据库，整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库，用于揭示差异蛋白参与的信号通路和代谢途径。 |
蛋白聚类与互作分析
| 聚类与互作 |  |
聚类热图聚类热图（heatmap）是通过排列矩阵的行列，将相似的数值放在一起展示聚类分析结果的图像，以直观呈现多样本多个蛋白的全局表达量变化，呈现多样本或多蛋白表达量的聚类关系。 |
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蛋白互作图蛋白互作图（PPI）预测蛋白之间相互作用的示意图，每一个圆形表示蛋白质，球之间的线条表示蛋白之间的相互关系。蛋白作为细胞功能执行者，不是凭借单个蛋白独立执行，而是依靠蛋白之间相互作用执行功能。 |
数据交付内容
蛋白定量总表
包含蛋白名称、蛋白编号、各通道定量值、组间差异倍数（Fold Change）和统计显著性（p-Value）。
差异蛋白筛选结果
火山图、热图等差异分析图表，按 Fold Change 和 p-Value 双重阈值筛选的差异蛋白列表。
原始质谱数据
全部 LC-MS/MS 原始数据文件（.raw），支持后续独立分析与回溯挖掘。
功能注释与可视化图表
GO 注释、KEGG 通路富集、蛋白互作网络分析、聚类热图等可直接用于论文投稿的可视化图表。
送样要求
| 样本类型 | 送样量/每个样本 |
|---|---|
| 细胞系 | 1×107 个 |
| 动物组织（鸡肉/器官） | 50mg |
| 动物组织（骨骼/软骨） | 500mg |
| 植物组织（叶片/花） | 200mg |
| 植物组织（种子/根茎） | 5g |
| 血清/体液 | 500μL |
| 酵母/微生物 | 300-400mg |
| 蛋白溶液 | 250μg |
* 具体的样本制备和保存要求请参考送样指南，或联系技术支持获取定制化送样方案。样本需 -80°C 保存，干冰运输。
检测平台：Thermo Fisher Orbitrap Exploris 480 / Q Exactive HF-X 高分辨质谱仪（分辨率 240,000 @ m/z 200，扫描速度 40 Hz），搭配 EASY-nLC 1200 纳升液相色谱系统 + HPLC-MS/MS
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参考文献
- Tian X, et al. Chemical isotope labeling for quantitative proteomics. Mass Spectrom Rev. 2021;42(2):546-576. DOI:10.1002/mas.21709 方法学，定量
- Sivanich MK, et al. Recent advances in isobaric labeling and applications in quantitative proteomics. PROTEOMICS. 2022;22(19-20):2100256. DOI:10.1002/pmic.202100256 综述，TMT
- Louca S, et al. Advances in data-independent acquisition mass spectrometry towards comprehensive digital proteome landscape. Mass Spectrom Rev. 2023;42(6):2324-2348. DOI:10.1002/mas.21781 DIA
- Li J, et al. Data-independent acquisition (DIA): an emerging proteomics technology for analysis of drug-metabolizing enzymes. Drug Discov Today Technol. 2021;39:49-56. DOI:10.1016/j.ddtec.2021.06.006 综述
常见问题
iTRAQ 最多可以同时比较几个样本？
iTRAQ 试剂支持 4 标（4-plex）和 8 标（8-plex）两种规格，最多可同时比较 8 个样本。标记后所有样本混合为一个组分进行 LC-MS/MS 分析，显著降低实验批次效应，提高定量准确性。如果您的研究样本数超过 8 个，建议选择 TMT（最多 18 标）或 DIA 无标记方案。
iTRAQ 与 TMT 有什么区别？
两者都是等重标记定量技术，原理相似。iTRAQ 最多 8 标，TMT 最多 18 标（TMTpro）。iTRAQ 报告基团质量范围较窄（114-121 Da），TMT 报告基团分布更广。iTRAQ 在 MS2 水平存在 ratio compression 效应，而 TMT 通过 MS3 采集可有效降低该效应。样本数量 ≤8 个推荐 iTRAQ，大样本队列推荐 TMT 或 DIA。
送样要求是什么？
细胞系 1×107 个，动物组织（鸡肉/器官）50mg，动物组织（骨骼/软骨）500mg，植物组织（叶片/花）200mg，植物组织（种子/根茎）5g，血清/体液 500μL，酵母/微生物 300-400mg，蛋白溶液 250μg。样本需 -80°C 保存，干冰运输。具体要求请参考送样指南。
典型鉴定多少个蛋白？
基于 Thermo Fisher Orbitrap Exploris 480 / Q Exactive HF-X 高分辨质谱平台，搭配高 pH 反相色谱分级，单次实验典型鉴定 5000-8000 个蛋白，定量 CV < 15%，重复性良好。鉴定深度与样本复杂度、分级策略相关。
项目周期多长？交付哪些内容？
标准交付周期约 3-4 周，从样本接收到数据报告交付。交付内容包括：原始质谱数据（.raw）、蛋白定量总表、差异蛋白筛选结果（火山图、热图等）、GO/KEGG 功能注释分析、蛋白互作网络分析、可直接用于投稿的可视化图表。如需生信深度分析可另行定制。
iTRAQ 适合大样本量研究吗？
iTRAQ 最多支持 8 个通道，适合中小规模样本（≤8 组）的精确定量比较。样本数超过 8 个时，建议选择 TMT（最多 18 标）或 DIA 无标记方案。对于数十到数百例的临床大队列，DIA 数据独立采集是更优选择，样本数量无上限且避免标记试剂成本。