蛋白序列分析是通过实验手段直接获取蛋白质氨基酸排列顺序的技术。与基于基因组预测或数据库搜索的间接推断不同，实验测序能够提供蛋白质的真实序列信息，对于抗体药物表征、多肽类药物开发和未知蛋白鉴定具有不可替代的价值。
Aimsmass 提供两种互补的蛋白测序方案：针对抗体药物的重头测序和针对多肽类样品的抗原肽重头测序，均采用 Edman 降解法和高分辨质谱 de novo 测序双平台策略，确保序列结果的完整性和准确性。
测序方案介绍
蛋白抗体重头测序 (Antibody De Novo Sequencing)
适用场景：单克隆抗体、双特异性抗体、抗体偶联药物 (ADC) 的完整序列表征，以及仿制抗体与原研药的序列比对验证。
分析内容：重链和轻链全长序列测定，CDR1/CDR2/CDR3 区精确鉴定，框架区 (FR) 序列确认，二硫键连接位点分析。
技术路线：抗体经还原和烷基化处理后，分别使用多种蛋白酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C 等）进行消化，产生覆盖完整序列的重叠肽段。肽段经高分辨 LC-MS/MS 分析后进行 de novo 序列推导，辅以 Edman 降解法验证关键区域（特别是 CDR 区）。
抗原肽重头测序 (Antigen Peptide De Novo Sequencing)
适用场景：多肽类药物序列验证、MHC 呈递抗原肽鉴定、天然抗菌肽测序、未知多肽成分分析。
分析内容：完整氨基酸序列测定，翻译后修饰位点鉴定（如酰胺化、焦谷氨酸化），N 端/C 端完整性评估，非天然氨基酸检测。
技术路线：纯化多肽经高分辨 LC-MS/MS 采集多级碎片谱图，通过 de novo 算法直接推导序列。对于 N 端封闭或含有特殊修饰的多肽，结合 Edman 降解法或化学衍生化策略进行辅助解析。
技术方法对比
| 参数 |
Edman 降解法 |
质谱 De Novo 测序 |
| 原理 |
N 端逐个切除氨基酸，PITC 衍生后 HPLC 鉴定 |
肽段 CID/HCD/ETD 碎裂，根据 b/y 离子推导序列 |
| 读取长度 |
30-60 个氨基酸/次 |
8-30 个氨基酸/肽段 |
| 通量 |
低（单一样品逐步分析） |
高（多肽段并行分析） |
| N 端封闭蛋白 |
无法直接分析 |
不受影响 |
| 修饰分析 |
有限 |
可同时鉴定多种修饰 |
| 样品纯度要求 |
高（需纯化蛋白 ≥90%） |
较低（可处理混合物） |
| Leu/Ile 区分 |
可区分 |
需特殊碎裂方式（如 ETD） |
服务流程
应用场景
抗体药物开发与表征
单克隆抗体、双特异性抗体、纳米抗体的 CDR 区序列精确鉴定，用于 IND 申报材料中的序列确认。仿制抗体与原研药的序列一致性比对，确保生物等效性。抗体工程改造中的突变位点验证。
多肽类药物质量控制
合成多肽药物的序列验证，确认合成产物的正确性。天然多肽（如抗菌肽、毒素肽）的序列测定，为新药发现提供序列基础。MHC 呈递抗原肽的鉴定，支持肿瘤免疫和疫苗研究。
未知蛋白与多肽鉴定
不依赖基因组信息的未知蛋白序列测定，适用于非模式生物来源的蛋白或多肽。蛋白组学研究中发现的新型多肽的序列确认。
送样要求
| 样品类型 |
最低量 |
纯度要求 |
保存条件 |
| 抗体溶液 |
≥50 μg (浓度 ≥1 mg/mL) |
≥95% (SEC-HPLC 验证) |
4°C 短期 / -20°C 长期 |
| 纯化蛋白 |
≥5 μg (Edman) / ≥1 μg (MS) |
≥90% (SDS-PAGE) |
-20°C 或 -80°C |
| 合成多肽 |
≥1 μg |
粗品或纯化品均可 |
-20°C 干粉或溶液 |
| IP 产物 |
视目标蛋白丰度 |
需 Western blot 验证 |
-80°C |
常见问题
什么是 de novo 重头测序？与数据库搜索有什么区别？
De novo 重头测序不依赖任何蛋白质数据库，直接根据质谱碎片离子谱图推导氨基酸序列。相比之下，数据库搜索是将实验谱图与理论谱图匹配，只能鉴定数据库中已有的蛋白。重头测序可发现全新的抗体序列和未知多肽，是抗体药物表征的首选方法。
Edman 降解法和质谱测序法各自的优缺点是什么？
Edman 降解法从 N 端逐个切除氨基酸进行鉴定，准确性高但通量低，且无法分析 N 端封闭的蛋白。质谱 de novo 测序通量高、可处理修饰肽段，但对谱图质量要求高，某些同重氨基酸（如 Leu/Ile）难以区分。两者互补使用可获得最完整的序列信息。
抗体 CDR 区测序为什么很重要？
CDR（互补决定区）是抗体与抗原结合的关键区域，其氨基酸序列直接决定抗体的特异性和亲和力。通过重头测序获取 CDR 区的精确序列，对于抗体药物开发、仿制药表征和抗体工程改造至关重要。
重头测序能处理多大的蛋白？
质谱 de novo 测序主要获得的是肽段水平的序列（通常 8-30 个氨基酸），完整蛋白序列需要通过多条重叠肽段拼接获得。对于抗体（约 150 kDa），通常分别对重链和轻链进行测序后组装。Edman 降解法每次可读取 30-60 个氨基酸。
蛋白序列分析需要多少样品？
Edman 降解法需要纯化的蛋白样品，建议 ≥5 μg 纯度 ≥90%。质谱 de novo 测序灵敏度更高，纯化蛋白 ≥1 μg 即可，复杂混合物中目标蛋白也可通过 IP 富集后测序。抗体样品建议浓度 ≥1 mg/mL，体积 ≥20 μL。
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