为了敲除目的基因，必须将核酸酶 Cas9 和靶标特异性向导 RNA 递送到细胞中。各种 CRISPR 平台适用于产生敲除，包括"多合一"或单质粒系统、双质粒系统和 RNP 复合体递送。Aimsmass 采用 RNP 复合体递送方式，具有加速基因编辑动力学、降低脱靶效应和无外源 DNA 插入等优势。
CRISPR/Cas9 系统是快速生成敲除细胞系的强大工具。很多敲除细胞系已经在众多科研工作中被证明是有用的，为基因功能研究、药物靶点验证和疾病模型构建提供了可靠的实验工具。
单克隆化的重要性
基因、表观遗传和表型水平的异质性是单克隆化过程中需要关注的重要因素。不同的单克隆可能表现出不同的敲除效率和表型特征，例如 MDA-MB-231 细胞的不同克隆间可观察到显著差异。因此，分析多个独立的 KO 细胞系对于排除克隆特异性变异、确认表型与基因敲除的因果关系至关重要。建议至少分析 2-3 个独立克隆。
在单细胞增殖过程中，选择压力和 Cas9 诱导的 DNA 损伤应答可能影响克隆的生长特性。因此，合适的对照细胞系（如空载体对照或非靶向 sgRNA 对照）对于正确解释实验结果同样重要。
实验流程
| 步骤 | 内容 |
|---|
| 细胞转染 | 优化细胞转染流程，导入 Cas9 RNP 复合物 |
| 基因编辑 | 导入复合物后，细胞中进行基因编辑（NHEJ 修复产生 Indel） |
| 细胞分选 | 对成功导入基因的细胞进行抗生素筛选或荧光分选 |
| 敲除验证 | Sanger 测序进行基因组水平验证 |
| 单克隆筛选 | 有限稀释法或流式分选，挑选单克隆细胞并进行多层次验证 |
服务优势
已成功敲除数据
超过 80% 靶点敲除效率，大量成功案例验证方案的可靠性。
敲除效率验证
采取 Sanger 测序 + 深度蛋白组双验证，从基因组和蛋白两个层面确认敲除效果。
RNP 递送优势
Cas9 RNP 复合体递送，加速基因编辑动力学，降低脱靶效应，无外源 DNA 插入（DNA-free）。
常见问题
KO 稳定细胞系和 KO 细胞池有什么区别？
KO 稳定细胞系经过单克隆化筛选，所有细胞携带相同的基因编辑，遗传背景均一，实验可重复性最高，适合正式的功能研究和药物开发。KO 细胞池是未经单克隆化的混合群体，包含多种编辑类型的细胞，构建周期短但均一性较低，适合初步验证和快速筛选。
为什么要分析多个独立的 KO 细胞系？
不同的单克隆可能具有不同的遗传/表观遗传背景和表型特征。分析多个独立的 KO 克隆可以排除克隆特异性变异的影响，确认观察到的表型确实由目标基因敲除引起，而非克隆化过程中的随机变异。建议至少分析 2-3 个独立克隆。
构建 KO 稳定细胞系需要多长时间？
标准流程约 6-10 周：sgRNA 设计与克隆（1 周）、RNP 制备与细胞转染（1 周）、抗生素筛选（2-3 周）、单克隆化与扩增（2-3 周）、基因型鉴定与蛋白验证（1-2 周）。难转染或生长缓慢的细胞系可能需要更长时间。
如何验证 KO 稳定细胞系的敲除效果？
验证分为三个层次：①基因组水平——Sanger 测序确认编辑位点，T7E1 酶切实验评估编辑效率；②转录水平——RT-qPCR 检测 mRNA 表达变化；③蛋白水平——Western blot 确认蛋白表达消失。Aimsmass 的交付报告包含完整的多层次验证数据。
Aimsmass 使用什么技术构建 KO 细胞系？
Aimsmass 采用 Cas9 RNP 复合体递送方式构建 KO 细胞系。RNP 递送的优势包括：加速基因编辑动力学、降低脱靶效应、无外源 DNA 插入（DNA-free）。相比传统质粒转染，RNP 方式更适合需要严格安全性控制的应用场景。
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