TMT 定量蛋白组学概述
TMT（Tandem Mass Tag）是 Thermo Fisher 开发的高通量等重标记定量技术，可在一次 LC-MS/MS 实验中同时比较 10 个（TMT 10-plex）或 16 个样本（TMTpro 16-plex），是目前通量最高的定量蛋白组学方案。TMT 试剂由报告基团（reporter group）、质量平衡基团（balance group）和肽段反应基团（peptide reactive group）三部分组成，所有标记的肽段在一级质谱中具有相同质量，但在 MS2/MS3 碎裂后释放不同质量的报告基团，根据报告基团的信号强度实现多样本蛋白的相对定量。[1]
相比 iTRAQ 的 4/8 标，TMT 的 16 标规格特别适合大样本队列研究（如临床样本分型、时间序列实验、多组织平行比较），可显著减少批次效应，提高统计效力。TMTpro 16-plex 试剂的报告基团质量范围更广（126-134 Da 及其同位素变体），搭配 MS3 采集模式可有效解决 MS2 定量的 ratio compression 问题，确保定量准确性。[2]
TMT 标记后多样本混合上机的设计使得所有样本在完全相同的质谱条件下分析，技术变异最小化。结合高 pH 反相色谱分级和 Orbitrap 高分辨质谱平台，单次实验可实现 6000-10000 个蛋白的深度覆盖和精确定量。[3]
TMT 定量蛋白组学的研究价值
TMT 高通量标记定量蛋白组学可对多组样本进行一次性同时比较，在大规模临床队列、时间序列动态研究和多组织平行分析中发挥核心作用。
大样本队列临床分型
TMTpro 16 标可一次实验比较 16 个样本，显著减少大样本队列研究的批次效应。在肿瘤分型、药物疗效预测等临床研究中，16 通道同时分析确保了组间可比性，适合数十到上百例样本的系统性蛋白质组分型。[4]
时间序列动态蛋白质组
利用 TMT 多通道同时标记不同时间点的样本，可精确追踪蛋白表达的动态变化轨迹。在发育生物学、药物时间-效应研究和细胞信号动态响应等研究中，TMT 的时间序列设计避免了分次上机带来的技术偏差。
多组织多条件平行比较
TMT 16 标通道允许在同一实验中平行比较多种组织类型或多种处理条件，例如不同脑区、不同药物剂量梯度等，一次实验获得全面的蛋白表达谱差异，为系统性生物学研究提供高通量数据支撑。
Aimsmass 检测流程
Aimsmass 基于专业的 Thermo Fisher LC-MS/MS 质谱平台，提供高效、可靠的 TMT 定量蛋白组学服务。标准检测流程如下：
TMT 标准检测流程
样本前处理：适配细胞、组织、血清、微生物等多种样本类型，采用质谱兼容体系完成蛋白提取、还原烷基化、胰蛋白酶完整酶解，确保肽段质量和定量准确性。
TMT 标记：使用 TMT 10-plex 或 TMTpro 16-plex 试剂标记肽段 N 端和赖氨酸侧链氨基。不同样本分别标记不同的报告基团标签，标记后混合为一个组分。
色谱分级与 LC-MS/MS 采集：混合后样本进行高 pH 反相色谱分级以降低复杂度，各级分再通过纳流反相色谱分离进入 Orbitrap 质谱，采用 MS3 采集模式获取报告基团信号。
专业生信解析：基于 MaxQuant / Proteome Discoverer 进行搜库鉴定，提取各通道报告基团信号强度完成相对定量。执行严格的 FDR 质控，输出差异蛋白列表及全套可视化图表。
TMT vs iTRAQ vs DIA 对比
| 对比维度 | TMT 标记定量 | iTRAQ 标记定量 | DIA 无标记定量 |
|---|---|---|---|
| 标记方式 | 等重标记（10/16-plex） | 等重标记（4/8-plex） | 无标记 |
| 最大通道数 | 18 通道（TMTpro） | 8 通道 | 无上限 |
| 定量准确性 | MS3 模式，CV < 15% | MS2 模式，CV < 15% | CV < 15% |
| Ratio Compression | MS3 有效消除 | MS2 水平存在 | 不存在 |
| 批次效应 | 标记后混合，最低 | 标记后混合，最低 | 需严格质控 |
| 标记成本 | 较高 | 中等 | 无标记试剂，最低 |
| 适用样本量 | ≤18 组精确比较 | ≤8 组精确比较 | 大样本量队列 |
| 可重分析性 | 需重新标记 | 需重新标记 | 原始数据可反复挖掘 |
| 推荐场景 | 大样本队列 / 多组比较 | 中小规模精确定量 | 临床大队列筛选 |
数据分析
TMT 定量蛋白组学数据分析涵盖统计分析、功能注释分析和蛋白聚类与互作分析三大板块，全面展示蛋白表达差异和生物学功能信息。
统计分析
| 统计分析 |  |
全局统计分析所有鉴定到蛋白表达量的分布范围，每条曲线表示一个样本，分布是经过正态分布拟合处理后的，图中纵坐标为频数，横坐标为表达量 log10 后的数值。 |
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箱式图箱式图又称盒须图、盒式图或者箱线图，是一种表现有关数据的位置和分散情况资料的统计图。箱型图主要包含六个数据节点，可粗略表达出数据是否有对称性、分散程度等信息。 | |
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PCA 分析主成分分析（PCA 分析）是数理统计中的一种降维分析方法，将一组数据的主要矛盾提取出来，提取出的核心要素成为"成分"（component），并以百分比排序。排名靠前的主成分可以反应复杂数据中的关键信息。 | |
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火山图火山图（Volcano Plot）在一张图中显示了两个重要指标（Fold Change / p-Value），可以非常直观且合理地筛选出在样本之间发生差异表达的蛋白。 |
功能注释分析
| 功能注释 |  |
GO 注释基因的本体论（Gene Ontology）是建立一套特定的词汇集合来描述生物学功能，以此对基因功能注释统一化。用于描述生物学功能的词汇反映生物学功能的本质。 |
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KEGG 分析京都基因与基因组百科全书（KEGG）是基因组破译方面的数据库，整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库，用于揭示差异蛋白参与的信号通路和代谢途径。 |
蛋白聚类与互作分析
| 聚类与互作 |  |
聚类热图聚类热图（heatmap）是通过排列矩阵的行列，将相似的数值放在一起展示聚类分析结果的图像，以直观呈现多样本多个蛋白的全局表达量变化，呈现多样本或多蛋白表达量的聚类关系。 |
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蛋白互作图蛋白互作图（PPI）预测蛋白之间相互作用的示意图，每一个圆形表示蛋白质，球之间的线条表示蛋白之间的相互关系。蛋白作为细胞功能执行者，不是凭借单个蛋白独立执行，而是依靠蛋白之间相互作用执行功能。 |
数据交付内容
蛋白定量总表
包含蛋白名称、蛋白编号、各通道定量值、组间差异倍数（Fold Change）和统计显著性（p-Value）。
差异蛋白筛选结果
火山图、热图等差异分析图表，按 Fold Change 和 p-Value 双重阈值筛选的差异蛋白列表。
原始质谱数据
全部 LC-MS/MS 原始数据文件（.raw），支持后续独立分析与回溯挖掘。
功能注释与可视化图表
GO 注释、KEGG 通路富集、蛋白互作网络分析、聚类热图等可直接用于论文投稿的可视化图表。
送样要求
| 样本类型 | 送样量/每个样本 |
|---|---|
| 细胞系 | 1×107 个 |
| 动物组织（鸡肉/器官） | 50mg |
| 动物组织（骨骼/软骨） | 500mg |
| 植物组织（叶片/花） | 200mg |
| 植物组织（种子/根茎） | 5g |
| 血清/体液 | 500μL |
| 酵母/微生物 | 300-400mg |
| 蛋白溶液 | 250μg |
* 具体的样本制备和保存要求请参考送样指南，或联系技术支持获取定制化送样方案。样本需 -80°C 保存，干冰运输。
检测平台：Thermo Fisher Orbitrap Exploris 480 / Q Exactive HF-X 高分辨质谱仪（分辨率 240,000 @ m/z 200，扫描速度 40 Hz），搭配 EASY-nLC 1200 纳升液相色谱系统 + HPLC-MS/MS
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参考文献
- Tian X, et al. Chemical isotope labeling for quantitative proteomics. Mass Spectrom Rev. 2021;42(2):546-576. DOI:10.1002/mas.21709 方法学，定量
- Sivanich MK, et al. Recent advances in isobaric labeling and applications in quantitative proteomics. PROTEOMICS. 2022;22(19-20):2100256. DOI:10.1002/pmic.202100256 综述，TMT
- Louca S, et al. Advances in data-independent acquisition mass spectrometry towards comprehensive digital proteome landscape. Mass Spectrom Rev. 2023;42(6):2324-2348. DOI:10.1002/mas.21781 DIA
- Li J, et al. Data-independent acquisition (DIA): an emerging proteomics technology for analysis of drug-metabolizing enzymes. Drug Discov Today Technol. 2021;39:49-56. DOI:10.1016/j.ddtec.2021.06.006 综述
常见问题
TMT 最多可以同时标记几个样本？
TMT 提供两种规格：TMT 10-plex（10 标）和 TMTpro 16-plex（16 标）。16 标适用于大样本队列研究，如临床样本分型、时间序列实验等。标记后所有样本混合为一个组分进行 LC-MS/MS 分析，显著降低实验批次效应。
TMT 与 iTRAQ 相比有什么优势？
TMT 最大优势是通量更高（16 标 vs 8 标），可一次实验比较更多样本，减少批次效应。TMTpro 16 标试剂的报告基团质量范围更广，搭配 MS3 采集模式可有效解决 MS2 水平的 ratio compression 问题，定量准确性更高。样本数量 ≤8 个推荐 iTRAQ，≤16 组推荐 TMT。
送样量要求是多少？
每个样本需要总蛋白 ≥ 100μg，浓度 ≥ 1μg/μL。组织样本 100-200mg，细胞 2×107 以上。建议提供生物学重复（至少 3 个），以确保统计可靠性。具体要求请参考送样指南。
TMT 实验的典型鉴定深度？
基于 Thermo Fisher Orbitrap Exploris 480 平台，采用 MS3 采集模式，搭配高 pH 反相色谱分级，单次实验可鉴定 6000-10000 个蛋白，定量 CV < 15%。鉴定深度与样本复杂度、分级策略和采集模式相关。
数据分析包含哪些内容？
标准分析包括：蛋白鉴定与定量、差异表达分析（火山图、热图等）、GO/KEGG 功能注释、蛋白互作网络（PPI）、亚细胞定位分析。可定制高级分析如 PTM 联合分析、时间序列聚类等。交付内容包括原始质谱数据（.raw）和可直接用于投稿的可视化图表。
TMT 和 DIA 应该如何选择？
样本数 ≤16 组且追求精确定量推荐 TMT（MS3 模式，CV < 15%，批次效应最低）；样本数 >16 组或临床大队列推荐 DIA（样本量无上限，可重分析性高）。TMT 标记后混合上机批次效应最低，DIA 无标记试剂成本更低且原始数据可反复挖掘。