高通量敲除服务

AIMS 专业服务

CRISPR-Cas9 系统允许科学家改变任何基因组的目标区域。这种快速而廉价的技术已经革命性地改变了基础研究，并承诺将对个性化疾病治疗和精准农业产生深远影响。CRISPR 编辑是一种普适性工具，使更多研究人员能够在他们的研究中利用基因组工程，而无需优化 CRISPR 方法学。

RNP 复合体定位其基因组目标时，gRNA 碱基对与互补 DNA 链配对，引导 Cas9 蛋白到特定位点产生双链断裂 (DSB)。细胞通过两种主要途径修复 DSB：非同源末端连接 (NHEJ) 和同源定向修复 (HDR)。NHEJ 修复过程中产生的插入或缺失突变 (Indel) 可导致阅读框移码，从而实现基因敲除。

递送方法

编辑的效率和准确性取决于 Cas9 和 gRNA 进入细胞的方式。常用方法包括：病毒转导（慢病毒或 AAV）、脂质体转染和电穿孔。对于原代细胞和难转染细胞，核转染 (nucleofection) 是 RNP 直接递送的首选方法，可显著提高编辑效率。

RNP 的直接递送需要分离纯化 Cas9 蛋白和引导 RNA，在体外组装成 RNP 复合体后导入细胞。相比质粒转染，RNP 递送具有更快的编辑动力学、更低的脱靶效应和无外源 DNA 插入风险等优势。

实验流程

gRNA 构建

设计与克隆

细胞准备

确认培养条件

RNP 制备

Cas9-gRNA 复合体

细胞转染

电穿孔/脂质体

接种培养

转染后扩增

效率验证

Sanger + 蛋白组

服务优势

已成功敲除数据

超过 80% 靶点敲除效率，大量成功案例验证方案的可靠性。

敲除效率验证

采取 Sanger 测序 + 深度蛋白组双验证，从基因组和蛋白两个层面确认敲除效果。

敲除周期缩短

3 天敲除效率可达到 80% 以上，显著缩短研究周期。

敲除成本降低

优化的 RNP 递送方案降低成本，满足高通量敲除的应用需求。

常见问题

高通量 CRISPR 敲除的效率有多高？

Aimsmass 的高通量 CRISPR 敲除效率可达 80-90%，通过优化 gRNA 设计和 RNP 递送条件实现。敲除效率通过 Sanger 测序和深度蛋白组学双重验证，确保结果的可靠性。

敲除细胞池和稳定细胞系有什么区别？

敲除细胞池是未经单克隆化筛选的异质细胞群体，构建周期短（约 3 天），成本低，适合初步功能验证和高通量筛选。稳定细胞系经过单克隆化，遗传背景均一，实验可重复性更高，适合正式的功能研究和药物开发。

RNP 直接递送相比质粒转染有什么优势？

RNP（核糖核蛋白复合体）直接递送的优势包括：①基因编辑动力学更快，Cas9 蛋白和 gRNA 直接作用于细胞核；②脱靶效应降低，因为 RNP 在细胞内的半衰期短于质粒表达；③无外源 DNA 插入风险（DNA-free），更适合临床应用。

高通量敲除适合哪些应用场景？

高通量敲除适合：①sgRNA 文库筛选——全基因组或定制化基因集合的功能筛选；②药物靶点快速验证——在多个靶点上同时测试敲除效果；③合成致死筛选——在特定突变背景下筛选合成致死基因；④信号通路研究——系统性敲除通路组分。

项目周期和验证方法？

高通量敲除的标准周期约 3-5 天即可获得敲除细胞池。验证采用 Sanger 测序和蛋白组学双重方法：Sanger 测序确认基因组编辑位点，蛋白组学验证蛋白水平的敲除效果。如需单克隆化稳定细胞系，周期约 6-10 周。