大多数细胞生物学实验使用短暂转染方案，在转染后的 24-96 小时内达到基因表达的峰值。然而，如果需要长时间持续的基因表达调控，构建稳定的细胞系是一个可行的选择。此外，通过限制稀释选择的稳定细胞系提供了遗传同质和克隆的细胞群体。
稳定细胞系的构建可以通过使用阳性选择标记物（如 hygromycin、G418/Geneticin、zeocin 和 blasticidin 抗生素耐药性）来实现。共转染时，目标基因载体和选择标记载体的比例通常为 5:1，以确保筛选到的细胞同时携带目标基因。
构建步骤
利用 CRISPR/Cas9 或 shRNA 构建稳定敲低细胞系的步骤如下：
| 步骤 | 操作内容 |
|---|
| 1. sgRNA/shRNA 验证 | 设计并验证靶向序列的特异性和效率 |
| 2. 确定基因拷贝数 | 评估目标基因的基因组拷贝数 |
| 3. 质粒质量控制 | 使用高纯度质粒 DNA |
| 4. 细胞状态确认 | 确保细胞处于良好培养状态 |
| 5. 设计与合成引物 | 合成 sgRNA/shRNA 和基因型鉴定引物 |
| 6. 细胞转染/转导 | 慢病毒感染或脂质体转染 |
| 7. 抗生素筛选 | 使用适当选择标记筛选阳性细胞 |
| 8. 单细胞克隆分离 | 有限稀释法或流式分选 |
| 9. PCR/测序筛选 | 筛选基因表达降低的克隆 |
| 10. 扩增阳性克隆 | 扩增验证阳性的克隆 |
| 11. Western blot 验证 | 蛋白水平确认敲低效果 |
| 12. 冻存保种 | 检测支原体污染并冻存稳定细胞系 |
构建 KD 稳定细胞系的优势
持续的基因沉默
shRNA 整合到基因组后可实现长期稳定的基因沉默，无需反复转染。
同质性和克隆性
有限稀释法提供基因同质的细胞群体，确保实验可重复性。
减少变异
克服瞬时转染的变异问题，获得一致的实验结果。
实验设计灵活性
可加入诱导系统，实现条件性基因敲低，灵活安排实验时间节点。
多功能性
适用于基因功能研究、信号通路分析、药物筛选和重组蛋白质生产等多种应用场景。
常见问题
KD 敲低和 KO 敲除如何选择？
CRISPR KO 敲除在 DNA 水平永久性失活基因，适合研究基因完全丧失功能的效应。shRNA KD 敲低在 mRNA 水平降低表达（通常 70-95%），适合研究：①必需基因——完全敲除可能导致细胞死亡；②剂量效应——研究不同表达水平对表型的影响；③可逆性研究——需要恢复基因表达以验证表型可逆性。
shRNA 和 siRNA 有什么区别？
siRNA 是双链 RNA 分子，通过瞬时转染进入细胞，效果持续 3-7 天。shRNA 是短发夹 RNA，通过慢病毒载体整合到基因组中，可实现持续稳定的基因沉默。稳定表达 shRNA 的细胞系适合需要长期基因沉默的实验。
构建 KD 稳定细胞系需要多长时间？
标准流程约 4-8 周：shRNA 设计与克隆（1 周）、慢病毒包装（1-2 周）、细胞感染与筛选（2-3 周）、单克隆化与验证（1-2 周）。具体周期取决于细胞类型和筛选难度。
如何验证 KD 细胞系的敲低效率？
主要通过 RT-qPCR 检测 mRNA 水平的表达变化，以及 Western blot 检测蛋白水平的表达变化。一般要求 mRNA 水平降低 70% 以上方认为敲低有效。Aimsmass 提供完整的 qPCR 和 WB 验证数据。
Aimsmass 提供哪些类型的 KD 细胞系？
Aimsmass 提供：单基因/多基因敲低、短基因/长基因敲低、单克隆/混合克隆、自有细胞株/客供细胞株。可根据研究需求灵活定制 KD 细胞系构建方案。
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