等电聚焦 (IEF) 是确定蛋白质等电点 (pI) 最常用的方法。在 IEF 过程中，给定样品的蛋白质通过 pH 梯度凝胶电泳分解。由于蛋白质在 IEF 中的电泳迁移率取决于它们的净正电荷或负电荷，一旦达到中性 pH 值（蛋白质不再携带净正电荷或负电荷的 pH 值），蛋白质就会保持在相应的 pH 值中稳定。这个蛋白质变成中性（或等电）的 pH 值称为蛋白质的 pI。

蛋白质在固定 pH 梯度凝胶 (IPG) 上的电泳迁移率取决于其总正电荷（酸性）或负电荷（碱性），这是 IEF 技术的基本原理。因此，蛋白质的 pI 表示其净电荷，这是决定其在特定环境中稳定性/活性的关键因素。通常，第一维 IPG-IEF 之后是第二维 SDS-PAGE，聚焦的蛋白质被变性/还原并在凝胶上解析，用于随后的免疫印迹来验证蛋白质的身份。

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