基因编辑是现代功能基因组学研究的核心工具。CRISPR-Cas9 系统通过 sgRNA 引导 Cas9 核酸酶在基因组特定位点产生双链断裂 (DSB)，利用细胞自身的非同源末端连接 (NHEJ) 修复途径引入插入或缺失突变 (Indel)，从而实现基因敲除。结合慢病毒递送系统和单克隆化筛选技术，可构建遗传稳定的基因敲除细胞系。
对于必需基因或需要研究剂量效应的场景，RNA 干扰 (RNAi) 技术通过 shRNA 在转录后水平降解 mRNA，实现可调控的基因敲低 (Knockdown)，是对 CRISPR 敲除策略的重要补充。
服务方案对比
| 参数 |
高通量敲除筛选 |
KO 稳定细胞系 |
KD 稳定细胞系 |
KO 细胞池 |
| 编辑机制 |
CRISPR-Cas9 / sgRNA 文库 |
CRISPR-Cas9 / 单条 sgRNA |
shRNA / 慢病毒 |
CRISPR-Cas9 / 单条或多条 sgRNA |
| 编辑效果 |
基因完全敲除 |
基因完全敲除 |
mRNA 水平降低 70-95% |
基因敲除（混合群体） |
| 通量 |
全基因组 / 定制文库 |
单基因 / 少量基因 |
单基因 / 少量基因 |
单基因 |
| 细胞群体 |
混合群体（筛选后分析） |
单克隆化均一群体 |
单克隆化均一群体 |
混合群体（未单克隆化） |
| 交付周期 |
8-12 周 |
6-10 周 |
4-8 周 |
3-5 周 |
| 适用场景 |
药物靶点发现、合成致死筛选 |
基因功能验证、表型研究 |
必需基因功能、剂量效应 |
快速验证、初步功能探索 |
| 验证内容 |
NGS 富集分析 |
Sanger + WB + qPCR |
qPCR + WB |
Sanger + WB（可选） |
服务流程
应用场景
药物靶点发现与验证
全基因组 CRISPR 筛选可系统性鉴定肿瘤细胞存活、增殖、迁移和耐药性相关的必需基因，发现潜在的药物靶点。结合蛋白质组学数据（如 DIA 定量蛋白组学），可从蛋白功能层面验证筛选结果，提高靶点发现的可靠性。
信号通路与基因功能研究
通过构建特定基因的 KO 或 KD 稳定细胞系，结合下游表型实验（增殖、凋亡、迁移、侵袭等），揭示基因在特定信号通路中的功能角色。CRISPR 敲除适合完全丧失功能的研究，shRNA 敲低适合研究必需基因的部分功能或剂量依赖效应。
合成致死筛选
在特定基因突变背景下筛选合成致死伙伴基因，为精准医疗提供治疗策略。例如在 BRCA1/2 突变的肿瘤细胞中筛选合成致死基因，发现新的联合用药靶点。高通量 sgRNA 文库筛选是合成致死研究的金标准方法。
技术平台
| 技术要素 |
说明 |
| CRISPR 系统 |
SpCas9 (标准) / SpCas9-HF1 (高保真) / Cas12a (替代 PAM) |
| sgRNA 设计 |
基于 Rule Set 2 / DeepHF 算法优化，最小化脱靶效应 |
| 慢病毒递送 |
第三代自灭活慢病毒载体，生物安全等级 2 (BSL-2) |
| 筛选方法 |
Puromycin / Blasticidin / Hygromycin 抗性筛选，GFP/BFP 荧光分选 |
| 单克隆化 |
有限稀释法 / 流式分选单细胞 |
| 验证手段 |
Sanger 测序 + T7E1 + RT-qPCR + Western blot |
常见问题
CRISPR-Cas9 敲除和 shRNA 敲低有什么区别？
CRISPR-Cas9 敲除 (KO) 通过在基因组 DNA 水平产生双链断裂，导致基因永久性失活，敲除效率高且稳定遗传。shRNA 敲低 (KD) 在 mRNA 水平降解转录本，降低但不完全消除基因表达，效果可逆。选择 KO 还是 KD 取决于研究目的：KO 适合研究基因必需性和功能丧失，KD 适合研究必需基因的部分功能或剂量效应。
稳定细胞系和细胞池有什么区别？
稳定细胞系 (Stable Cell Line) 是经过单克隆化筛选的均一细胞群体，所有细胞携带相同的基因编辑，实验可重复性最高。细胞池 (Pool) 是未经单克隆化的混合群体，包含多种编辑类型的细胞，构建周期短但均一性较低。细胞池适合初步验证和快速筛选，稳定细胞系适合正式的功能研究和药物开发。
高通量敲除筛选的 sgRNA 文库如何设计？
sgRNA 文库设计需要考虑以下因素：每个基因通常设计 3-6 条 sgRNA 以降低脱靶效应；选择外显子区域（特别是靠近起始密码子的早期外显子）以最大化敲除效率；避免与基因组其他区域高度同源的序列；加入阴性对照（非靶向 sgRNA）和阳性对照（必需基因 sgRNA）。常用的文库包括 GeCKO、Brunello 和 CRISPRko 等。
构建一个 KO 稳定细胞系需要多长时间？
标准流程约 6-10 周：sgRNA 设计与克隆（1 周）、慢病毒包装（1-2 周）、细胞感染与抗生素筛选（2-3 周）、单克隆化与扩增（2-3 周）、基因型鉴定与蛋白验证（1-2 周）。复杂细胞系或难转染细胞可能需要更长时间。
如何验证基因敲除的效率？
验证分为多个层次：①基因组水平——Sanger 测序或 T7E1 酶切实验确认基因组编辑位点；②转录水平——RT-qPCR 检测 mRNA 表达变化；③蛋白水平——Western blot 确认蛋白表达消失。对于 KO 稳定细胞系，三个层次的验证均为必须。Aimsmass 提供的交付报告包含完整的多层次验证数据。
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