Labelfree 非标记定量蛋白组学概述
通过使用稳定同位素标记可以使蛋白定量结果准确稳定，然而也有其自身限制，比如额外的样本处理标记步骤、高昂的试剂成本、标记效率问题、低丰度肽段损失以及样本检测通量受限等。采用非标记蛋白定量（Labelfree）可以避免这些问题的烦恼。[1]
Labelfree 是通过比较质谱分析次数或质谱峰强度，分析不同来源样本蛋白的数量变化，利用相关统计软件（MaxQuant / Proteome Discoverer）对蛋白质进行定量。每个样本独立运行 LC-MS/MS，无需化学标记试剂，样本数量不受通道数限制，目前已经成为蛋白质组学领域内较为快速和经济高效的解决方案。[2]
Labelfree 定量支持 DDA（数据依赖采集）和 DIA（数据非依赖采集）两种模式。DDA 适合发现型研究，DIA 覆盖更全面、重复性更好。结合 MaxQuant 的 match between runs 功能，可以跨运行对齐定量信号，最大限度减少 missing values。[3]
Labelfree 非标记定量的研究价值
Labelfree 非标记定量技术突破了标记试剂的通道数限制，在超大样本队列研究、临床样本分析和预算敏感项目中具有不可替代的优势。
超大样本队列研究
当样本数量远超 iTRAQ（8 标）或 TMT（16 标）的通道数限制时，Labelfree 是唯一可行的定量方案。在流行病学研究、多中心临床试验和大规模药物筛选中，Labelfree 可处理数十到数百个样本的定量比较，无通道上限。[4]
特殊样本类型分析
某些样本类型不适合化学标记，如临床 FFPE 组织切片（标记效率低）、稀有微量样本（标记损失大）、特殊体液（脑脊液、眼泪等蛋白含量极低）。Labelfree 直接分析无需标记，最大限度减少样本损失。
经济高效的发现型研究
在预算有限但需要全面覆盖蛋白组的探索性研究中，Labelfree 省去了昂贵的标记试剂成本（iTRAQ/TMT 试剂每套数千元），将预算集中在更多生物学重复和更深的质谱覆盖上。
DDA vs DIA 采集模式
Labelfree 定量支持两种质谱采集模式，选择哪种取决于研究目的和样本规模：
DDA 数据依赖采集
发现型 Top-N 经典方案选择信号强度排名前 N 的母离子进行 MS2 碎裂鉴定。优势是鉴定深度高、数据分析流程成熟（MaxQuant 原生支持）；缺点是低丰度肽段可能被遗漏，跨运行重复性稍差。
适用场景：发现型研究、小样本量（<20 个）深度鉴定、需要最大化蛋白覆盖的初探实验。
DIA 数据非依赖采集
全覆盖 SWATH 高重复性将全质量范围划分为固定窗口，每个窗口内所有母离子同时碎裂。优势是覆盖全面、重复性极好（CV < 10%）、可重分析性高；缺点是需要谱图库或 library-free 算法（DIA-NN）解析。
适用场景：大样本队列（>20 个）、需要高重复性的纵向研究、需要后续反复挖掘数据的项目。
Aimsmass 检测流程
Aimsmass 基于专业的 Thermo Fisher LC-MS/MS 质谱平台，提供高效、可靠的 Labelfree 定量蛋白组学服务。标准检测流程如下：
Labelfree 标准检测流程
样本前处理：适配细胞、组织、血清、微生物等多种样本类型，采用质谱兼容体系完成蛋白提取、还原烷基化、胰蛋白酶完整酶解，确保肽段质量。
LC-MS/MS 独立采集：每个样本独立运行纳流反相色谱-串联质谱分析。DDA 模式选择 Top-N 母离子碎裂，DIA 模式全窗口采集。随机化上机顺序以消除系统偏差，间隔插入 QC 质控样本监控仪器稳定性。
信号对齐与定量：使用 MaxQuant（DDA）或 Spectronaut/DIA-NN（DIA）进行跨运行信号对齐和定量。DDA 模式通过 match between runs 减少 missing values，DIA 模式通过谱图库匹配实现全面定量。
统计分析与功能注释：执行严格的统计质控，输出差异蛋白列表及全套可视化图表（火山图、热图、GO/KEGG 注释、PPI 网络等）。
Labelfree vs iTRAQ/TMT vs DIA 对比
| 对比维度 | Labelfree (DDA) | iTRAQ / TMT | DIA |
|---|---|---|---|
| 标记方式 | 无标记 | 等重标记（4-18-plex） | 无标记 |
| 样本量限制 | 无上限 | ≤18 个/批 | 无上限 |
| 标记成本 | 无标记试剂，最低 | 较高（试剂昂贵） | 无标记试剂，最低 |
| 批次效应 | 需严格质控 | 标记后混合，最低 | 较低（窗口固定） |
| 定量 CV | 15-20% | < 15% | < 10% |
| 鉴定深度 | 4000-6000 蛋白 | 5000-10000 蛋白 | 5000-8000 蛋白 |
| 可重分析性 | 需重新采集 | 需重新标记 | 原始数据可反复挖掘 |
| 数据分析 | MaxQuant (成熟) | MaxQuant/PD (成熟) | 需专门软件 (DIA-NN 等) |
| 推荐场景 | 超大队列 / 预算敏感 | 中小规模精确定量 | 大样本高重复性 |
数据分析
Labelfree 定量蛋白组学数据分析涵盖统计分析、功能注释分析和蛋白聚类与互作分析三大板块，全面展示蛋白表达差异和生物学功能信息。
统计分析
| 统计分析 |  |
全局统计分析所有鉴定到蛋白表达量的分布范围，每条曲线表示一个样本，分布是经过正态分布拟合处理后的，图中纵坐标为频数，横坐标为表达量 log10 后的数值。 |
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箱式图箱式图又称盒须图、盒式图或者箱线图，是一种表现有关数据的位置和分散情况资料的统计图。箱型图主要包含六个数据节点，可粗略表达出数据是否有对称性、分散程度等信息。 | |
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PCA 分析主成分分析（PCA 分析）是数理统计中的一种降维分析方法，将一组数据的主要矛盾提取出来，提取出的核心要素成为"成分"（component），并以百分比排序。排名靠前的主成分可以反应复杂数据中的关键信息。 | |
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火山图火山图（Volcano Plot）在一张图中显示了两个重要指标（Fold Change / p-Value），可以非常直观且合理地筛选出在样本之间发生差异表达的蛋白。 |
功能注释分析
| 功能注释 |  |
GO 注释基因的本体论（Gene Ontology）是建立一套特定的词汇集合来描述生物学功能，以此对基因功能注释统一化。用于描述生物学功能的词汇反映生物学功能的本质。 |
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KEGG 分析京都基因与基因组百科全书（KEGG）是基因组破译方面的数据库，整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库，用于揭示差异蛋白参与的信号通路和代谢途径。 |
蛋白聚类与互作分析
| 聚类与互作 |  |
聚类热图聚类热图（heatmap）是通过排列矩阵的行列，将相似的数值放在一起展示聚类分析结果的图像，以直观呈现多样本多个蛋白的全局表达量变化，呈现多样本或多蛋白表达量的聚类关系。 |
 |
蛋白互作图蛋白互作图（PPI）预测蛋白之间相互作用的示意图，每一个圆形表示蛋白质，球之间的线条表示蛋白之间的相互关系。蛋白作为细胞功能执行者，不是凭借单个蛋白独立执行，而是依靠蛋白之间相互作用执行功能。 |
数据交付内容
蛋白定量总表
包含蛋白名称、蛋白编号、各样本定量值（LFQ intensity）、组间差异倍数和统计显著性。
差异蛋白筛选结果
火山图、热图等差异分析图表，按 Fold Change 和 p-Value 双重阈值筛选的差异蛋白列表。
原始质谱数据
全部 LC-MS/MS 原始数据文件（.raw），支持后续独立分析与回溯挖掘。
功能注释与可视化图表
GO 注释、KEGG 通路富集、蛋白互作网络分析、聚类热图等可直接用于论文投稿的可视化图表。
送样要求
| 样本类型 | 送样量/每个样本 |
|---|---|
| 细胞系 | 1×107 个 |
| 动物组织（鸡肉/器官） | 50mg |
| 动物组织（骨骼/软骨） | 500mg |
| 植物组织（叶片/花） | 200mg |
| 植物组织（种子/根茎） | 5g |
| 血清/体液 | 500μL |
| 酵母/微生物 | 300-400mg |
| 蛋白溶液 | DDA ≥ 50μg，DIA ≥ 100μg |
* 具体的样本制备和保存要求请参考送样指南，或联系技术支持获取定制化送样方案。样本需 -80°C 保存，干冰运输。建议生物学重复至少 3 个（DIA 可降至 2 个）。
检测平台：Thermo Fisher Orbitrap Exploris 480 / Q Exactive HF-X 高分辨质谱仪（分辨率 240,000 @ m/z 200，扫描速度 40 Hz），搭配 EASY-nLC 1200 纳升液相色谱系统 + HPLC-MS/MS
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参考文献
- Tian X, et al. Chemical isotope labeling for quantitative proteomics. Mass Spectrom Rev. 2021;42(2):546-576. DOI:10.1002/mas.21709 方法学，定量
- Sivanich MK, et al. Recent advances in isobaric labeling and applications in quantitative proteomics. PROTEOMICS. 2022;22(19-20):2100256. DOI:10.1002/pmic.202100256 综述，TMT
- Louca S, et al. Advances in data-independent acquisition mass spectrometry towards comprehensive digital proteome landscape. Mass Spectrom Rev. 2023;42(6):2324-2348. DOI:10.1002/mas.21781 DIA
- Li J, et al. Data-independent acquisition (DIA): an emerging proteomics technology for analysis of drug-metabolizing enzymes. Drug Discov Today Technol. 2021;39:49-56. DOI:10.1016/j.ddtec.2021.06.006 综述
常见问题
Labelfree 与 iTRAQ/TMT 有什么区别？
Labelfree 无需化学标记试剂，直接比较不同 LC-MS/MS 运行中肽段的信号强度。优势是不受标记通道数限制，可比较任意数量样本；成本更低，无标记试剂费用。缺点是需要更严格的实验重复性控制，批次效应较标记方法（iTRAQ/TMT）略高。
DDA 和 DIA 采集模式有什么区别？
DDA（数据依赖采集）选择 top-N 强度母离子碎裂，适合发现型研究，数据分析流程成熟。DIA（数据非依赖采集）对所有母离子窗口式碎裂，覆盖更全面，重复性更好（CV < 10%），适合大样本队列。DIA 数据分析需要专门的谱图库或 library-free 算法（如 DIA-NN）。如需更详细的 DIA 方案说明，请参考 DIA 定量蛋白组学专题页面。
Labelfree 适用于什么场景？
适用于：样本数量超过 iTRAQ/TMT 通道限制的情况；临床样本（无法统一标记）；稀有样本（标记损失大）；预算有限的大规模筛选研究；需要后续重分析的项目（尤其 DIA 模式）。当样本数 ≤8 组且追求精度时，推荐 iTRAQ；≤16 组推荐 TMT。
送样要求是什么？
蛋白总量 ≥ 50μg/样本（DDA）或 ≥ 100μg/样本（DIA），浓度 ≥ 0.5μg/μL。建议生物学重复至少 3 个（DIA 可降至 2 个，因重复性更好）。样本需 -80°C 保存，干冰运输。具体要求请参考送样指南。
典型鉴定深度和重复性？
DDA 模式典型鉴定 4000-6000 蛋白，DIA 模式可达 5000-8000 蛋白。DIA 定量 CV 通常 < 10%，优于 DDA 的 15-20%。DIA 的可重分析性极高，原始数据可反复挖掘新信息，适合长期纵向研究。
Labelfree 的批次效应如何控制？
Labelfree 每个样本独立运行，需要严格的实验设计控制批次效应：随机化上机顺序、插入 QC 质控样本、使用内标校正。DIA 模式因采集窗口固定，批次效应较 DDA 更低。MaxQuant 的 match between runs 功能可跨运行对齐定量，减少 missing values。